Utilisation des small Heat shock proteins en biotechnologie

Auteur: Florian Ronez, thèse de doctorat, 2012.

L’activité de chaperon moléculaire des sHsp in vivo induite par des stress environnementaux en font des protéines intéressantes pour protéger les cellules. Mais leur activité de chaperon moléculaire et de lipochaperon in vitro permet également d’imaginer de nombreuses applications dans le domaine des biotechnologies. Plusieurs applications ont décrites dans la bibliographie et/ou ont été brevetées.

1.     Stabilisation de protéines

         i.            Stabilisation de protéines en solution

Les sHsp ayant la capacité de protéger les protéines des phénomènes d’agrégation, leur application sur des protéines d’intérêt a donc été testée. Une étude brevetée aux Etats Unis a montré que la sHsp de Pyrococcus furiosus peut protéger la Taq polymérase de très hautes températures et améliorer les rendements de la PCR (Laksanalamai et al., 2006; Robb et al., 2007). Lorsqu’il y a peu de Taq polymérase dans le mix PCR la présence de la sHsp permet une meilleure amplification de l’ADN.

D’autres enzymes comme HindIII et le lysozyme ont pu conserver leur activité lors de chocs thermiques en présence de la Pfu-sHsp (Chen et al., 2006), ou encore l’enzyme de restriction EcoRI qui est protégée de l’inactivation thermique par HspA de Xanthomonas campestris (Lin et al., 2010). Les protéines utilisées en industrie pharmaceutique sont parfois sensibles. Un brevet déposé aux Etats Unis montre que Hsp17.5 du châtaignier peut stabiliser l’insuline en solution à 37°C. De plus Hsp27 de drosophile peut également stabiliser l’insuline jusqu’à 44°C (Quinlan, 2004). On peut donc envisager de transposer cette activité protectrice sur d’autres modèles protéiques sensibles.

       ii.            Stabilisation de protéines fixées à un support

Les bio-puces sont des surfaces actives conçues pour analyser l’ADN ou les protéines. Elles permettent d’automatiser et de miniaturiser des réactions enzymatiques pour effectuer des analyses au sein d’une cellule unique. Lorsque les protéines ne sont pas dans leur milieu optimal (pH, température, forces ioniques, etc…) elles deviennent instables et sensibles à l’agrégation. La construction de bio-puces à protéines rencontre plusieurs limitations liées à ces problèmes, et c’est dans ce cas que les sHsp pourraient être utilisées. La fixation efficace de protéines sur des matrices est délicate, une fois les protéines fixées il faut que celles-ci conservent une conformation active avec des sites actifs tournés vers l’acceptation de substrats. Lors de cette étape de fixation il y a souvent une perte d’activité importante des protéines (Wehtje et al., 1993), qui est souvent palliée en fixant de grandes quantités de protéines. Cependant cette perte d’activité se poursuit souvent dans le temps avec une altération et/ou dégradation progressive des protéines fixées.

La durée de vie des surfaces actives de bio-puces est un des freins les plus importants à leur développement. En effet, lorsqu’elles ne rencontrent pas leurs substrats les protéines fixées ont tendance à perdre leur conformation initiale ce qui mène à l’exposition des parties hydrophobes (Iversen & Thorlacius-Ussing, 1996) et la possible agrégation avec les substrats lors de leur rencontre, créant des erreurs de mesure et une altération irréversible de la bio surface.

Pour une utilisation en routine pour des fonctions de diagnostic, les bio puces doivent pouvoir permettre des résultats fiables et reproductibles dans le temps. Les essais pour améliorer la demi vie des protéines ou peptides fixés sur les bio puces se limitent souvent à des modifications et optimisations des tampons (Wienhues et al., 1996). Cela peut s’avérer efficace mais doit être mis au point au cas par cas. Une méthode universelle de stabilisation des bio-puces pourrait donc être imaginée sur la base des nombreux substrats que les sHsp peuvent prendre en charge. Il a été démontré (Ehrnsperger et al., 1998) que Hsp25 de murine est capable de se lier à des substrats protéiques afin de stabiliser l’activité enzymatique de protéines et la conformation antigénique de peptides utilisés dans le cadre d’immunodétection pour le diagnostic d’infections virales. Les complexes formés avec les sHsp n’interférant ni avec la détection immunologique ni avec les activités enzymatiques et antigéniques. Ces complexes sHsp/substrats se sont montrés stables, ce même après plusieurs semaines avec des activités enzymatiques et antigéniques préservées.

2.     Aide au repliement des protéines

Les protéines chaperonnes peuvent également avoir une application intéressante non plus comme stabilisant ajouté au milieu mais comme protéines fixées sur une matrice. Certaines approches ont permis de restaurer une partie de l’activité enzymatique de la luciférase thermiquement désactivée (Yang et al., 2003). Bien entendu les sHsp seules n’ont pu permettre de récupérer l’activité enzymatique perdue, et donc un repliement de la luciférase, mais cela a été possible en utilisant une combinaison de DnaK fixé à une surface de verre avec ses cochaperons et des protéines alpha-cristallin en solution.

Ces observations ouvrent la voie pour des applications de Hsp fixées sur supports dans la conservation de protéines d’intérêt, ou fixées sur colonnes pour restaurer l’activité de protéines. On peut restaurer la conformation des protéines agrégées, par exemple en ajoutant des Hsp libres dans le milieu L’intérêt d’une colonne avec Hsp greffées serait de s’affranchir d’une étape de purification supplémentaire des protéines après leur repliement. De telles tentatives ont été effectuées (Altamirano et al., 1997, 2001) avec le développement d’une matrice d’agarose greffée de GroEL/ES, DsbA, et une isomérase, ou encore d’une membrane greffée du même complexe GroEL/ES. Ces systèmes se sont montrés assez efficaces mais avec une détérioration rapide des protéines greffées et donc une limite d’utilisation successives assez faible. C’est ici que pourraient intervenir les sHsp, d’une part (i) en participant à la présentation des protéines à renaturer aux chaperons universels mais également (ii) en stabilisant ces derniers et permettant une augmentation de la durée de vie des systèmes de renaturation. Cependant, il y a un frein à cette utilisation qui est la nature oligomérique dynamique des sHsp, qui pose la question de savoir sous quelle forme la sHsp exerce son activité afin de fixer cette forme active sur la matrice. L’étude Hsp26 modifiée (Franzmann et al., 2005) chez laquelle toutes les sous unités d’un oligomère sont liées de manière covalente par ponts disulfures est encourageante car son activité est restée inchangée par rapport à Hsp26 sauvage.

3.     Protection face à la dégradation par les protéases

Il n’existe aucun protocole universel pour améliorer l’inhibition des protéases, et chaque technique doit être mise au point finement pour éviter au maximum les biais dus à ces protéases. L’utilisation de sHsp pour prévenir leur action serait donc très intéressante.

Nous avons vu que les sHsp ont une activité dans la protection des protéines en cours de dénaturation, il semblerait que cette association avec une sHsp protège également la protéine substrat contre la protéolyse (Han et al., 2005; LeThanh et al., 2005). Cette capacité de protection contre la dégradation par les protéases cellulaires peut aussi trouver un intérêt en biotechnologie et des utilisations de IbpA, IbpB, et Hsp26 comme agent protecteur contre les protéases lors de purifications de protéines d’intérêt ont été brevetées pour les Etats Unis (Lee, 2005).

Cette propriété peut également aider à l’étude des protéomes. En effet lors de la préparation d’une électrophorèse bidimensionnelle (Electrophorèse 2D), les protéines à étudier sont soumises à un stress dû au changement de milieu et à l’action des protéases cellulaires. Les différentes étapes précédant le dépôt des extraits protéiques sur gel, et particulièrement la lyse cellulaire, peuvent endommager les protéines. Pour faire face à ce problème il est possible d’annihiler l’activité enzymatique de l’extrait cellulaire en utilisant des inhibiteurs de protéases comme l’EDTA, la benzamidine et le DTT, ou ajouter des détergents, ou en chauffant l’extrait. Mais l’inhibition n’est jamais totale (Finnie & Svensson, 2002). Cette inhibition partielle ou les traitements trop intenses peuvent mener à l’apparition de profils électrophorèse 2D non conformes et donc fausser les interprétations.

Des études réalisées (Han et al., 2005) ont permis de montrer que les sHsp sont capables de protéger les protéines de la dégradation par la trypsine et la protéinase K in vitro. Sur d’autres  modèles, les sHsp IbpA, IbpB de E. coli et Hsp26 de S. cerevisiae ajoutées à divers extrait cellulaires de E. coli avant électrophorèse 2D se sont montrées efficaces comparées à divers inhibiteurs de protéases.

Les résultats ont montré non pas une augmentation du nombre de protéines détectées mais une amélioration de l’intensité et de la définition des spots sur le gel. La transposition de ces manipulations à d’autres extraits protéiques plus fragiles a cette fois ci montré une détection de 50% de spots en plus que les gels 2D effectués avec des inhibiteurs de protéases classiques. Les auteurs ont ici démontré une application très intéressante et performante des sHsp dans l’étude du protéome qui a fait l’objet d’un dépôt de brevet (Lee, 2005).

4.     Intérêt thérapeutique

Comme évoqué précédemment l’agrégation des protéines est à l’origine de nombreuses maladies, principalement d’ordre neurodégénératives. Considérant cela des utilisations thérapeutiques des sHsp sont envisageables. L’utilisation de Hsp20 de Babesia bovis, un protozoaire parasite des ruminants, a permis de prévenir l’agrégation de protéines impliquées dans la formation des fibroses amyloïdes (Ficht et al., 2005; Lee et al., 2005). Ces études ont été menées in vitro mais sont encourageantes car elles ont permis d’inhiber la neurotoxicité provoquée par la formation des agrégats.

5.     Applications destinées à l’industrie agroalimentaire

Les bactéries lactiques sont utilisées dans des processus industriels, en particulier pour la fabrication des produits laitiers dans lesquels elles jouent des rôles dans les processus d’acidification, de modifications aromatiques et rhéologiques (El Demerdash et al., 2003). Nous avons vu que certaines bactéries lactiques possèdent une ou plusieurs sHsp, la surexpression de ces dernières pourrait permettre de conférer de nouvelles propriétés aux microorganismes. Un brevet a été déposé aux Etats Unis quant à l’utilisation d’un plasmide permettant la surexpression de sHsp chez Streptococcus thermophilus et Lactococcus lactis (Geis et al., 2003). La présence de ce plasmide chez les bactéries lactiques a permis une résistance accrue à l’attaque de bactériophages lors de fermentations à hautes températures. De plus l’expression de sHsp a permis aux bactéries lactiques de continuer de se développer jusqu’à 60°C et d’effectuer la fermentation jusqu’à 50°C, ce qui pourrait s’avérer intéressant dans les pays méditerranéens où les températures en fromageries sont souvent élevées. De plus, une résistance aux hautes teneurs en sels a été démontrée ce qui serait également intéressant dans les pays chauds où de fortes concentrations en sels sont ajoutées au lait afin d’augmenter son temps de conservation. Les bactéries surproduisant la sHsp ont également montré une meilleure résistance aux faibles pH lors de l’acidification des produits laitiers ce qui permettrait d’atteindre des pH plus bas.

Copyright: Florian Ronez, thèse de doctorat, 2012.

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