Surproduction hétérologue chez Escherichia coli et chaperons moléculaires

Auteur: Florian Ronez, thèse de doctorat, 2012.

Mon travail dans le cadre de l’activité de R&D de la société Nexidia a été de tester de nouvelles applications potentielles de sHsp, et la première de ces applications concerne l’utilisation des sHsp pour favoriser la surexpression de protéines hétérologues chez E. coli. En effet, de telles stratégies ont été développées avec des chaperons universels mais très peu traitent plus précisément des sHsp.

Cette partie traitera de la surproduction de protéines hétérologues chez E. coli, des problèmes rencontrés ainsi que des stratégies traditionnellement mises en œuvre pour lutter contre ses problèmes. Enfin nous nous focaliserons sur l’utilisation des Hsp et sHsp dans ces stratégies d’amélioration des rendements de production.

1.     Intérêt de la surproduction chez E. coli

Le développement de l’ingénierie moléculaire permet d’utiliser les organismes vivants comme de véritables usines pour la production de protéines d’intérêt (Punt et al., 2002; Westers et al., 2004; Barnes & Dickson, 2006). Cette surproduction hétérologue présente de nombreux avantages (Swartz, 2001). Elle permet ainsi de produire fidèlement tous types de protéines, en grande quantité, avec des rendements importants, une grande facilité, une automatisation, une application à l’échelle industrielle et un affranchissement des méthodes pétrochimiques. La production de protéines complexes par voie chimique est souvent impossible ou très couteuse, et l’extraction de certaines protéines à partir de substances naturelles est également couteuse (Esen, 1986).

La production hétérologue de protéines est donc aujourd’hui encore un enjeu majeur en biotechnologie. De nombreux systèmes de surproduction ont été développés chez de nombreux organismes comme les plantes (tabac), les champignons (SaccharomycesPichia, Hansenula), les algues (Chlamydomonas), les cellules d’insectes (Spodoptera frugiperda) ou encore les cellules de mammifères (cellules d’ovaires de hamster, myélomes) (Punt et al., 2002; León-Bañares et al., 2004; Barnes & Dickson, 2006; Mett et al., 2008). Mais les bactéries et en particulier E. coli restent les organismes les plus utilisés (Baneyx, 1999). En effet les avantages chez cette bactérie sont nombreux, une croissance rapide, un coût de culture relativement faible, une connaissance importante du métabolisme, un génome complètement séquencé pour plusieurs souches, et de nombreux outils moléculaires disponibles pour induire une forte expression des gènes codant pour les de protéines hétérologues comme les plasmides pET (Novagen) ou pGEX (GE Healthcare). La surproduction de protéines chez E. coli est aujourd’hui très répandue (Thomas & Baneyx, 1997) et utilisée en industrie à grande échelle pour la production de médicaments, vaccins, enzymes, protéines modifiées…

2.     Problèmes liés à la surproduction hétérologue

La production hétérologue chez E. coli n’est pas toujours simple et avant d’arriver à un système de routine de nombreuses optimisations sont souvent nécessaires. En effet la réponse de la bactérie à la surproduction n’est pas prévisible et des problèmes de faibles rendements de production, voire de non production, peuvent apparaitre.

D’autre part la production trop importante de protéines hétérologues dans un hôte peut entrainer la dégradation et/ou l’agrégation des protéines qui s’accumulent alors sous forme d’agrégats massifs de protéines mal repliées et en général inactives (Villaverde & Mar Carrió, 2003; Schrödel & Marco, 2005). Ces agrégats sont appelés corps d’inclusion (Thomas & Baneyx, 1996). Il sont la cause de rendements de production faibles voire une absence de protéines solubles ce qui empêche toute purification des protéines d’intérêt sous forme native (Machida et al., 1998). De plus l’accumulation de corps d’inclusion entraine un ralentissement de la croissance bactérienne et à terme conduit à la mort cellulaire.

1.     Stratégies d’amélioration des rendements

Il existe deux grandes catégories de méthodes pour l’obtention de protéines solubles chez E. coli, soit en amont en jouant sur la quantité de protéines produites dans la cellule, soit en aval en agissant sur les corps d’inclusion.

a.      Solubilisation des corps d’inclusion

Les premières approches ont consisté à récupérer les protéines agrégées dans les corps d’inclusion et de les ressolubiliser in vitro (Vallejo & Rinas, 2004) dans des tampons de renaturation contenant de l’urée et divers détergents. Ces procédures de repliement sont longues, complexes, et impliquent de nombreuses dialyses successives ou procédés chromatographiques, et sans garantie de récupération d’une protéine correctement repliée et active (Ventura & Villaverde, 2006).

b.      Modifications des paramètres de culture

Un des  moyens le plus simple généralement utilisé pour tenter de diminuer la formation de corps d’inclusion est de diminuer la température de culture de E. coli (Schein, 1989; Mujacic et al., 1999). Cette méthode a été efficace pour de nombreuses protéines comme la luciférase, la β-lactamase, la glycogène phosphorylase de lapin, ou l’interféron α-2 (Vasina & Baneyx, 1997). La diminution de température permet une exposition moindre des régions hydrophobes des protéines qui participent à la formation des corps d’inclusion, et également a pour conséquence une diminution de l’activité des protéases (Chesshyre & Hipkiss, 1989) qui participent à la formation des corps d’inclusion. De plus, la baisse de température a pour effet un ralentissement du métabolisme cellulaire avec pour conséquence une production protéique moindre, ce qui en soit est un avantage pour un meilleur repliement des protéines produites. C’est en revanche une contrainte car la biomasse produite et la quantité de protéines sont inférieures (Shaw & Ingraham, 1967; Vasina & Baneyx, 1996). Cette approche basée sur une baisse de  température de croissance pour les bactéries  peut donner des résultats satisfaisants mais n’est pas systématiquement la solution pour éviter la formation des corps d’inclusion.

Les conditions de culture sont également une cible intéressante pour produire une protéine hétérologue chez E. coli. En effet la plupart du temps, la biomasse est obtenue en culture discontinue (Batch). C’est donc la croissance bactérienne qui va influencer les conditions du milieu. La concentration des nutriments, l’accumulation de produits inhibiteurs, la concentration en oxygène dissous, ou encore la modification du pH sont autant de facteurs qui ne sont pas contrôlés et varient en batch. La culture en fermenteur permet de contrôler tous ces paramètres et d’éliminer ceux pouvant contribuer à l’apparition de corps d’inclusion. Il est même possible de suivre la formation des corps d’inclusion par cytométrie de flux (Fouchet et al., 1994; Lewis et al., 2004).

c.       Effet souches

L’utilisation intensive d’E. coli pour la surproduction de protéines, a conduit à la sélection de souches spécifiques à ce type d’utilisation comme les souches C41 (DE3) et C43 (DE3) qui ont montré de bons résultats bien que leurs mécanismes d’actions ne soient pas connus (Miroux & Walker, 1996; Arechaga et al., 2000; Steinfels et al., 2002; Sorensen et al., 2003). La stabilité des plasmides codant pour des protéines toxiques a même été améliorée chez ces deux souches (Dumon-Seignovert et al., 2004). Certaines souches commerciales de E. coli mutantes, comme la souche Origami (Novagen), ont été modifiées pour permettre un meilleur repliement des protéines et éviter la formation de corps d’inclusion. Pour la souche Origami des mutations dans les gènes codant pour la thiorédoxine réductase trxB et glutathion réductase gor permettent une meilleure formation des ponts disulfures dans le cytoplasme et donc un meilleur repliement des protéines contenant des ponts disulfures.

d.      Protéines fusion

Les approches présentées précédemment ne sont pas universelles et à développer au cas par cas, le but est aujourd’hui de développer une approche applicable à un grand nombre de protéines surexprimées. Il apparait donc nécessaire de développer des approches universelles. Certains auteurs ont tenté d’utiliser des protéines fusion contenant des tags permettant une solubilisation (Sorensen & Mortensen 2005). Les meilleurs activateurs de solubilité décrits sont la N-utilising substance A (NusA) et surtout la maltose binding protein (MBP) (Kapust & Waugh, 1999; Routzahn & Waugh, 2002; Fox et al., 2003). A la manière de souches Origami (Novagen), la fusion d’une protéine avec la thiorédoxine peut aider à la formation de ponts disulfures et donc son repliement (Jacquet et al., 1999). On estime que 80% des protéines testées voient leur solubilité améliorée lorsque elles sont exprimées avec un tag de solubilisation tel que la MBP, NusA, la thiorédoxine, etc… (Hammarström et al., 2002; Shih et al., 2002), ce qui souligne l’intérêt de cette approche.

L’utilisation du tag peut également présenter des limites quand celui-ci impacte sur la conformation et donc sur l’activité de la protéine purifiée.

e.      Utilisation de protéine chaperonnes

En conditions normales, un faible nombre de protéines cellulaire est capable de se replier spontanément (Anfinsen & others, 1973). La plupart des repliements nécessitent l’activité de chaperons moléculaires. Par conséquent, une autre approche éprouvée pour favoriser le repliement des protéines surproduites chez E. coli est de s’appuyer sur l’activité des chaperons. Cette approche sera développée plus en détails dans la partie suivante de l’étude bibliographique.

2.     Bilan

Aucune de ces approches n’est universelle mais celles présentant le plus de potentiel impliquent les protéines de choc thermique. La surproduction de protéines hétérologues chez E. coli entraine une réponse au stress de la cellule, mais les quantités de protéines synthétisées sont trop importantes et saturent les systèmes Hsp natifs de E. coli. Il apparait donc nécessaire d’induire dans la même cellule une surproduction de/des Hsp et de la protéine d’intérêt.

3.     Optimisation de solubilisation de protéines d’intérêt par coproduction de protéines chaperonnes

a.      Utilisation de protéines chaperonnes universelles

De nombreuses études mettant en œuvre des systèmes de coexpression avec des chaperons moléculaires universels comme DnaK et GroEL (Baneyx & Palumbo; Thomas et al., 1997) afin d’augmenter la solubilité de protéines, connues pour être produites sous forme de corps d’inclusion, sont décrites dans la littérature. La première démonstration a été réalisée chez E. coli avec la surproduction de GroEL/ES qui a permis d’augmenter la solubilité de la ribulose-1,5-diphosphate carboxylase/oxygénase ou rubisco (Goloubinoff et al., 1989). La coproduction avec des protéines chaperonnes peut être bénéfique pour augmenter la solubilité mais également pour améliorer les rendements de production(Lee & Olins, 1992; Sato et al., 1994; Marco et al., 2007). Cependant une meilleure solubilité des protéines produites grâce à la synthèse accrue de chaperon peut également conduire à des problèmes de protéolyse des protéines présentes en trop grande quantité dans le cytoplasme (Kandror et al., 1994; Sherman & Goldberg, 1996). La coexpression doit donc être à l’origine d’une réduction de la quantité de protéine d’intérêt produite. Les travaux réalisés sur la protéine de plante Cryj2 montrent que cette protéine est rapidement dégradée lorsqu’elle est surexprimée chez E. coli coproduisant DnaK. En absence de DnaK, il y a une agrégation importante de Criyj2. Pour conserver Cryj2 sous forme soluble, il faut surproduire DnaK ou GroEL/ES à des niveaux dix fois plus importants que le niveau natif mais il y a alors une perte de vitesse de croissance cellulaire de 25% (Nishihara et al., 1998).

Les chaperons les plus utilisés pour la coexpression sont GroEL/ES et DnaK/DnaJ/GrpE (Bukau & Horwich, 1998; Marco et al., 2007). DnaK/DnaJ/GrpE a permis par exemple d’augmenter la solubilité de l’endostatine, l’ORP150 humain, et la préS2-S’-β-galactosidase (Thomas & Baneyx, 1996; Nishihara et al., 2000). En ce qui concerne GroEL/ES, l’utilisation de ce système chaperon a permis d’améliorer la production hétérologue de l’ORP150 et du lysozyme humain, de la protéine kinase p50CSK, de la phosphomanose isomérase, ou encore la une oxydase du maïs, et la préS2-S’-β-galactosidase (Dale et al., 1994; Amrein et al., 1995; Proudfoot et al., 1996; Thomas & Baneyx, 1996; Nishihara et al., 2000; Marco et al., 2007). Des essais de coproduction de DnaK/DnaJ/GrpE ou GroEL/ES avec des protéines promptes à l’agrégation montrent donc un effet positif de ces chaperonnes sur la diminution de l’agrégation et donc une augmentation de la part de protéines soluble produite chez E. coli. Des plasmides commerciaux permettant cette coexpression sont disponibles. Ces mécanismes se sont montrés efficaces et sont axés non plus sur la ressolubilisation de protéines agrégées mais sur la protection et le repliement de protéines de novo produites (Sogo et al., 2000).

b.      L’utilisation des sHsp

Les sHsp ont également montré une certaine potentialité pour favoriser la surproduction hétérologue chez E. coli. Ces études ont été exclusivement menées sur les sHsp natives de E. coli IbpA et IbpB qui sont capables de protéger diverses protéines recombinantes surproduites contre l’agrégation (de Marco et al., 2000) et la dégradation par les protéases (Han et al., 2004; LeThanh et al., 2005). En outre des mutants d’E. coli n’exprimant pas IbpA et IbpB présentent des déficiences pour la production des protéines recombinantes sous une forme soluble. En absence d’IbpA et IbpB, la protéolyse est augmentée et l’on observe une perte de viabilité des bactéries productrices. En revanche, une surproduction de IbpA et IbpB permet une augmentation des taux de protéines recombinantes produites mais celles-ci se retrouvent majoritairement sous forme de corps d’inclusion coagrégées avec les sHsp (Mogk et al., 2003b; Han et al., 2004; LeThanh et al., 2005). Il existe donc un effet de seuil au-delà duquel IbpA et IbpB favorisent la formation de corps d’inclusion au lieu de les empêcher.

Un brevet américain fait état de l’utilisation d’une sHsp de l’α-cristallin humain dont la partie N-terminale a été tronquée ce qui lui confère une activité plus importante (Salerno et al.). Les séquences de la sHsp et son substrat, ici l’insuline, sont placées sur le même plasmide et les protéines sont donc exprimées simultanément. Les auteurs ont montré que ce système permettait de protéger l’insuline de son agrégation au sein de la cellule de E. coli.

c.       Efficacité des systèmes de coexpression avec des chaperons moléculaires ou des sHsp

Bien que les essais de coproduction d’un chaperon moléculaire avec des protéines d’intérêt aient été probants dans de nombreuses études aucun système universel n’a été mis en évidence. Certains systèmes de coproduction simultanés de plusieurs protéines chaperonnes ont fait leur preuve. La coexpression de DnaK et ClpB (Schlieker et al., 2002) a donné des résultats probants sur la protection des protéines cellulaires mais également la ressolubilisation de protéines agrégées. La coexpression du « trigger factor », protéine empêchant l’agrégation des polypeptides lors de la traduction, avec GroEL/ES ou DnaJ/DnaK/GrpE s’est également montrée efficace sur le repliement initial des protéines nouvellement synthétisée comme la protéines humaine ORP150, et le lysozyme (Nishihara et al., 2000). Enfin une approche de coproduction de GroEL/ES et IbpA/B, ainsi que DnaK/DnaJ/GrpE, GroEL/ES, ClpB IbpA/B a montré des augmentations des taux de solubilités de 20 protéines hétérologues différentes coproduites chez E. coli (Marco et al., 2007), cette étude constitue un premier pas vers un système de coproduction universel.

Nous avons vu que les chaperons sont des protéines qui agissent en coopération et/ou synergie. Les approches qui utilisent la coexpression de plusieurs d’entre eux se sont donc montrées les plus efficaces (Nishihara et al., 1998; Held et al., 2003; Marco et al., 2007) même si produire plus de protéines différentes implique une consommation plus importante des ressources cellulaires. De plus, ces coproductions risquent d’inhiber la croissance cellulaire (Ashiuchi et al., 1995; Nishihara et al., 1998). Cela est d’autant plus vrai qu’il faut également noter que la surproduction doit tenir compte des cofacteurs pour les systèmes de chaperons, en effet surproduire DnaK sans DnaJ conduit à de problèmes de division cellulaire (Blum et al., 1992), réduit le niveau des autres chaperons dans la cellule (Thomas & Baneyx, 1996) et altère la viabilité à 50°C.

Tous ces travaux laissent à penser qu’il pourrait y avoir une potentialité de la sHsp Lo18 coexprimée avec des protéines d’intérêt connaissant des problèmes de solubilité. La coexpression de Lo18 avec un chaperon universel tel que GroES/EL pourrait également être intéressante pour induire un repliement et une protection des protéines surexprimées chez E. coli. De tels systèmes ont été mis au point et testés durant ce travail de thèse.

Copyright: Florian Ronez, thèse de doctorat, 2012.

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