{"id":439,"date":"2012-08-29T10:38:29","date_gmt":"2012-08-29T08:38:29","guid":{"rendered":"http:\/\/www.youlab.fr\/blog\/?page_id=439"},"modified":"2012-08-29T10:38:29","modified_gmt":"2012-08-29T08:38:29","slug":"listeria-monocytogenes","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/www.youlab.fr\/blog\/ressources-scientifiques-bibliographie\/listeria-monocytogenes\/","title":{"rendered":"Caract\u00e9risation de Listeria monocytogenes et de sa capacit\u00e9 \u00e0 former des biofilms"},"content":{"rendered":"

Auteur: Fran\u00e7ois Xavier Bergeron, 2011. (NB: pour consulter les figures contacter l’auteur)<\/strong><\/span><\/p>\n

INTRODUCTION<\/h3>\n

1. Pr\u00e9sentation du Laboratoire<\/h3>\n

1.1. Pr\u00e9sentation de L\u2019INRA<\/h4>\n

Deuxi\u00e8me institut de recherche public fran\u00e7ais, les recherches de l\u2019Institut National de la Recherche Agronomique sont focalis\u00e9es sur trois th\u00e9matiques: l\u2019agronomie, l\u2019alimentation et l\u2019environnement. L\u2019Inra est rattach\u00e9 au minist\u00e8re de l\u2019Enseignement sup\u00e9rieur et de la Recherche ainsi qu\u2019au minist\u00e8re de l\u2019Agriculture, de l\u2019Alimentation, de la Ruralit\u00e9 et de l\u2019Am\u00e9nagement du territoire. Ses objectifs sont d\u2019obtenir une alimentation saine et de qualit\u00e9 avec une agriculture durable et comp\u00e9titive tout en pr\u00e9servant et valorisant l\u2019environnement. L\u2019Inra est ainsi le premier institut de recherche agronomique Europ\u00e9en et le deuxi\u00e8me dans le monde. Il compte environ 1800 chercheurs et 1900 th\u00e9sards et accueille chaque ann\u00e9e pr\u00e8s de 1500 chercheurs et \u00e9tudiants \u00e9trangers. L\u2019institut est compos\u00e9 de 208 unit\u00e9s de recherche dont 137 unit\u00e9s mixtes de recherche (UMR) associant l\u2019Inra \u00e0 d\u2019autres organismes de recherche ou d\u2019enseignement sup\u00e9rieur.<\/p>\n

\n

1.2. Pr\u00e9sentation du centre de DIJON<\/h3>\n

Depuis 1946 l\u2019Inra est pr\u00e9sent en Bourgogne. Le centre de Dijon reprend les m\u00eames th\u00e9matiques de recherche et d\u2019action que celles du national c\u2019est \u00e0 dire l\u2019alimentation, l\u2019agriculture et l\u2019environnement. Il est constitu\u00e9 de 12 unit\u00e9s dont 10 UMR et comprend 410 titulaires dont 200 chercheurs et ing\u00e9nieurs.
\n\u2022 L\u2019UMR Microbiologie du Sol et de l\u2019Environnement (MSE)
\nCette UMR est sous la tutelle de L\u2019INRA et de L\u2019Universit\u00e9 de Bourgogne et a trois axes de recherches. Dans un premier temps celui de d\u00e9finir les param\u00e8tres microbiens et g\u00e9ochimiques pour caract\u00e9riser la qualit\u00e9 des sols. Puis de conna\u00eetre et comprendre les processus microbiens pour pouvoir caract\u00e9riser les fonctions contribuant \u00e0 la qualit\u00e9 de notre environnement et de nos aliments. Et enfin celui de g\u00e9rer ou d\u2019orienter l\u2019activit\u00e9 et les fonctions des microorganismes concern\u00e9s pour par exemple r\u00e9duire l\u2019utilisation de pesticides et ainsi am\u00e9liorer la qualit\u00e9 de nos aliments.<\/p>\n

Avec ce stage j\u2019ai pu int\u00e9grer l\u2019\u00e9quipe 4 de l\u2019UMR MSE dont le responsable est Alain Hartmann. Cette \u00e9quipe a pour but de g\u00e9rer les populations microbiennes pathog\u00e8nes ou b\u00e9n\u00e9fiques dans les sols et l\u2019environnement.<\/p>\n

\n2. Pr\u00e9sentation du sujet<\/h3>\n

2.1. Listeria monocytogenes<\/h3>\n

Listeria monocytogenes (fig.1) est une bact\u00e9rie ubiquiste pouvant causer de s\u00e9v\u00e8res maladies qui m\u00e8nent \u00e0 l\u2019hospitalisation voir \u00e0 la mort (Mead et al., 1999). C\u2019est l\u2019agent pathog\u00e8ne de la List\u00e9riose. La list\u00e9riose humaine r\u00e9sulte principalement de l\u2019ingestion d\u2019aliments contamin\u00e9s, les personnes \u00e2g\u00e9es, enceintes, nouveaux n\u00e9s et personnes immunod\u00e9prim\u00e9es sont les plus susceptibles d\u2019\u00eatre atteints. Les personnes immunod\u00e9prim\u00e9es incluent les gens atteint du sida, ou prenant des m\u00e9dicaments immunosuppresseurs comme les corticost\u00e9ro\u00efdes pour les traitements du cancer (Rocourt et al., 1997).\u2028La list\u00e9riose \u00e0 un temps d\u2019incubation \u00e9lev\u00e9 ce qui rend difficile l\u2019identification du pathog\u00e8ne et la tra\u00e7abilit\u00e9 de l\u2019aliment contamin\u00e9.<\/p>\n

Le cycle infectieux de L.monocytogenes (Vasquez-Boland et al., 2001) et ses facteurs de virulence sont maintenant bien caract\u00e9ris\u00e9s (Renier et al., 2011). \u2028Le pathog\u00e8ne entre dans la cellule des mammif\u00e8res par phagocytose, la bact\u00e9rie est alors internalis\u00e9e dans une vacuole. Apr\u00e8s avoir lys\u00e9 la membrane de la vacuole, la bact\u00e9rie va pouvoir se d\u00e9placer dans la cellule gr\u00e2ce \u00e0 la formation d\u2019une queue d\u2019actine et ainsi coloniser d\u2019autres cellules.\u2028L\u2019infection se manifeste chez les patients par une m\u00e9ningite, une septic\u00e9mie ou bien encore par une maladie neuropathique (Vasquez-Boland et al., 2001).<\/p>\n

L. monocytogenes peut \u00eatre retrouv\u00e9e dans beaucoup de process alimentaire : produits laitier, produits laitier, radis, choux, produit de la mer … (Rocourt et al., 1997).<\/p>\n

L. monocytogenes peut survivre et se d\u00e9velopper dans un tr\u00e8s large \u00e9ventail de conditions environnementales, elles est psychrotrophe, r\u00e9siste \u00e0 des pH acide ou bien encore \u00e0 des concentrations de sel \u00e9lev\u00e9. On observe par exemple que soumis \u00e0 de faible pH, cela induit chez L .monocytogenes une r\u00e9ponse, la rendant r\u00e9sistante aux conditions acides (O\u2019Driscoll et al., 1996).<\/p>\n

Il y a donc une adaptation importante pour la survie de la part de L. monocytogenes aux conditions environnementales gr\u00e2ce \u00e0 des m\u00e9canismes tels que la formation de biofilms, le Quorum Sensing ou bien encore des r\u00e9sistances aux antibiotiques.<\/p>\n

\n2.2. Biodiversit\u00e9<\/h3>\n

L.monocytogenes pr\u00e9sente un niveau d\u2019h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 tr\u00e8s \u00e9lev\u00e9 d\u2019une souche \u00e0 l\u2019autre et plusieurs techniques ont \u00e9t\u00e9 d\u00e9velopp\u00e9es pour les diff\u00e9rencier.\u2028Le s\u00e9rotypage a \u00e9t\u00e9 la plus utilis\u00e9e et a permis de diff\u00e9rencier 4 s\u00e9rogroupes et 13 s\u00e9rotypes distincts : 1\/2a, 1\/2b, 1\/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4ab, 4c, 4d, 4e et 7. Une technique de g\u00e9nos\u00e9rotypage bas\u00e9es sur la PCR multiplex a \u00e9t\u00e9 d\u00e9velopp\u00e9e pour faciliter et acc\u00e9l\u00e9rer la discrimination des isolats (Doumith et al., 2004).\u2028Des diff\u00e9rences de virulence existent suivant les souches de L.monocytogenes, les donn\u00e9es \u00e9pid\u00e9miologiques indiquent que toutes les souches n\u2019ont pas la capacit\u00e9 de causer des maladies chez l\u2019Homme (Buchrieser et al., 2007). \u2028Les isolats provenant de seulement quatre (1\/2a; 1\/2c; 1\/2b et 4b) des 13 s\u00e9rotypes actuellement identifi\u00e9s sont responsables de plus de 98% des cas de list\u00e9rioses humaines signal\u00e9s (Jacquet et al., 2002).<\/p>\n

\n

2.3. Caract\u00e9ristiques des biofilms<\/h3>\n

Dans la nature, les microorganismes ne sont pas sous forme de cellules planctoniques mais en communaut\u00e9 dans les biofilms o\u00f9 ils sont attach\u00e9s \u00e0 une surface et enferm\u00e9s dans une matrice essentiellement constitu\u00e9e de polysaccharides mais aussi d\u2019autres compos\u00e9es comme des prot\u00e9ines ou de l\u2019ADN extracellulaire. Les cellules en biofilm diff\u00e8rent par beaucoup d\u2019aspects des cellules planctoniques. Hefford et al. (2005) montrent que pour une m\u00eame culture bact\u00e9rienne, il y a une plus forte expression des prot\u00e9ines qui sont impliqu\u00e9es dans la r\u00e9ponse au stress et dans les foncions de r\u00e9gulation de la cellule.<\/p>\n

Le biofilm conf\u00e8re une bonne protection contre les stress environnementaux (Pan et al., 2009) et permet ainsi aux microorganismes d\u2019augmenter leur r\u00e9sistance aux d\u00e9sinfectants et antibiotiques (Robbins et al., 2005).\u2028Les biofilms peuvent se former sur diff\u00e9rentes surfaces : mat\u00e9riels m\u00e9dicaux, tuyauteries, canalisations, \u00e9quipements industriels, comme les installations pour les process alimentaire (Donlan et al., 2001).<\/p>\n

La formation de biofilms au sien des process alimentaires et dans les installations de traitement est une pr\u00e9occupation car les bact\u00e9ries peuvent \u00eatre transf\u00e9r\u00e9es au produit alimentaire (Poimenidou et al., 2009; Koutsoumanis et al., 2010).<\/p>\n

Pour L.monocytogenes plusieurs \u00e9tudes ont montr\u00e9 que suivant les souches, la capacit\u00e9 \u00e0 adh\u00e9rer aux surface et donc \u00e0 former des biofilms \u00e9tait vari\u00e9e (Kalmokoff et al., 2001; Borucki et al., 2003).\u2028Une \u00e9tude montre une relation entre la formation de biofilm chez L.monocytogenes et la persistance dans l\u2019environnement (Kalmokoff et al., 2001).\u2028La formation de biofilm serait augment\u00e9e pour les souches persistantes dans le lait par rapport \u00e0 celles qui ne le sont pas. Cependant ces souches \u00abpersistantes\u00bb ne sont g\u00e9n\u00e9ralement pas impliqu\u00e9es dans les \u00e9pid\u00e9mies d\u2019origine alimentaire (Borucki et al., 2003).<\/p>\n

\n2.4. Formation et structure du biofilm<\/h3>\n

Le biofilm est g\u00e9n\u00e9ralement produit par une matrice extracellulaire produite par les bact\u00e9ries elle m\u00eames. La matrice extracellulaire, qui englobe la communaut\u00e9 de cellules dans le biofilm, est un m\u00e9lange complexe d’exopolysaccharides, d’ADN, de prot\u00e9ines, et d’autres substances polym\u00e9riques extracellulaires (polyglutamate, acides t\u00e9cho\u00efques, …) qui ont pour r\u00f4le de stabiliser la structure et de prot\u00e9ger les cellules dans le biofilm (Sutherland et al., 2001).\u2028Il a \u00e9t\u00e9 montr\u00e9 que la matrice du biofilm de L. monocytogenes contient de l’ADN extracellulaire (ADNe), qui joue un r\u00f4le important dans l’adh\u00e9sion initiale et les premiers stades de la formation de biofilm (Harmsen et al., 2010).\u2028La participation des flagelles dans la formation de biofilms a \u00e9galement \u00e9t\u00e9 soulign\u00e9, mais leur r\u00f4le exact dans le processus reste \u00e0 pr\u00e9ciser en raison des r\u00e9sultats contradictoires.\u2028Deux syst\u00e8mes de communication intercellulaires participeraient aussi \u00e0 la r\u00e9gulation de la formation de biofilm, le syst\u00e8me LuxS (Sela et al., 2006) et Agr (Rieu et al., 2007; Rieu et al., 2008 ; Garmyn et al., 2009)<\/p>\n

La formation de biofilm peut \u00eatre divis\u00e9e en plusieurs \u00e9tapes cl\u00e9s (fig.2):<\/p>\n

– l’adh\u00e9sion des bact\u00e9ries planctoniques est suivie de leur prolif\u00e9ration ult\u00e9rieure pour former des microcolonies.
\n– la maturation du biofilm dans une structure en trois dimensions
\n– la dispersion de certaines bact\u00e9ries lib\u00e9r\u00e9es par le biofilm, permettant aux cellules d\u2019aller coloniser d’autres surfaces (Renier et al., 2010)<\/p>\n

Il appara\u00eet que la structure des biofilms de L. monocytogenes d\u00e9pend d’une multitude de param\u00e8tres, \u00e0 savoir: la souche, le type de surface ainsi que d’autres conditions environnementales, comme le pH, et la temp\u00e9rature (Moltz & Martin et al., 2005; Renier et al., 2010).<\/p>\n

\nMATERIEL ET METHODES<\/h3>\n

1. Support biologique de travail<\/h3>\n

\u2022 Les diff\u00e9rentes souches :
\nL\u2019\u00e9tude a port\u00e9 sur 54 souches de Listeria monocytogenes. Ces souches proviennent pour la plupart d\u2019\u00e9chantillons collect\u00e9s entre Janvier 1991 et Novembre 1997 \u00e0 l’h\u00f4pital Philippe le Bon de Beaune. Les souches ScottA et EGDe proviennent quant \u00e0 elles de la collection de l\u2019institut Pasteur \u00e0 Paris.\u2028Les derni\u00e8res souches viennent soit du laboratoire d\u00e9partemental de la Haute Vienne soit de la collection du Laboratoire de Microbiologie UMR 1232 de Dijon.\u2028Le d\u00e9tail des souches et leurs caract\u00e9ristiques sont r\u00e9pertori\u00e9s dans le tableau 4 de l\u2019Annexe (Olier et al., 2002 ; Rousseaux et al., 2010).<\/p>\n

\u2022 Stock de souches :
\nLes souches \u00e9taient conserv\u00e9es dans des tubes \u00e0 cryocong\u00e9lation \u00e0 -80\u00b0C.
\n\u2022 Pr\u00e9culture des souches :
\nPour les diff\u00e9rents protocoles qui vont suivre il nous \u00e9tait n\u00e9cessaire de pr\u00e9parer les inocula bact\u00e9riens.
\nAvant chaque exp\u00e9rience, 100\u03bcl provenant des tubes du stock de travail sont inocul\u00e9s dans 10ml de TSB (Tryptic Soy Broth) et incub\u00e9s 24h \u00e0 25\u00b0C. 100\u03bcl sont alors inocul\u00e9s dans 10ml de TSB apr\u00e8s 24h \u00e0 25\u00b0C, cette seconde culture sert d\u2019inoculum.\u2028La puret\u00e9 des inocula \u00e9tait v\u00e9rifi\u00e9e par \u00e9talement sur une g\u00e9lose non s\u00e9l\u00e9ctive BHI (Brain Heart Infusion).<\/p>\n

\n

2. Cin\u00e9tique de croissance des souches<\/h3>\n

\nLe Bioscreen est un appareil qui permet le suivi de croissance bact\u00e9rienne, pour 200 \u00e9chantillons simultan\u00e9ment. \u2028Ceci nous permet d\u2019obtenir la courbe de croissance de chacune des souches.\u2028La microplaque du Bioscreen contient 100 puits que l\u2019on remplit de 300\u03bcl de culture. Les puits \u00e0 la p\u00e9riph\u00e9rie sont remplit de TSB seul pour \u00e9viter que la plaque ne s\u00e8che.\u2028 Il suffit ensuite de programmer l’appareil, dans notre cas le Bioscreen mesurait l\u2019absorbance \u00e0 600nm apr\u00e8s agitation toutes les 30min \u00e0 25\u00b0C.\u2028Apr\u00e8s 24h nous r\u00e9cup\u00e9rons le fichier excel contenant les donn\u00e9es cin\u00e9tiques des souches que l\u2019on avaient test\u00e9es.<\/p>\n

\n

3. Formation de biofilm<\/h3>\n

La capacit\u00e9 des souches \u00e0 former des biofilms \u00e9tait \u00e9valu\u00e9e en mesurant la quantit\u00e9 de biofilm form\u00e9e apr\u00e8s 16h d\u2019incubation \u00e0 25\u00b0C. Des micro-plaques de 96 puits sont utilis\u00e9es.\u2028Sur la plaque, la culture est repartie dans 10 puits \u00e0 raison de 100\u03bcL par puits.\u2028On veille aussi \u00e0 bien mettre du milieu sur tout les puits \u00e0 la p\u00e9riph\u00e9rie.\u2028Les plaques sont ensuite inocul\u00e9es 16h \u00e0 25\u00b0C.
\nAvec un laveur de plaque le surnageant est enlev\u00e9, seules les bact\u00e9ries qui ont form\u00e9 un biofilm avec la plaque restent. Les biofilms sont color\u00e9s 45min avec 100\u03bcl de cristal violet \u00e0 1%.\u2028L\u2019exc\u00e9dent de cristal violet est enlev\u00e9 puis une extraction \u00e0 l\u2019\u00e9thanol est faite en ajoutant 100\u03bcl d\u2019\u00e9thanol \u00e0 60%. On ajoute un film plastique pour prot\u00e9ger les puits et on laisse jusqu\u2019au lendemain.\u2028L\u2019absorbance de chaque puits \u00e0 600nm est alors mesur\u00e9e.<\/p>\n

4. Dosage de l\u2019ADN extracellulaire
\n\u2022 Pr\u00e9paration des \u00e9chantillons en milieu de phase exponentielle et en phase stationnaire
\n(apr\u00e8s 15 heures d\u2019incubation).
\n100\u03bcL de culture sont additionn\u00e9s \u00e0 900\u03bcL de TS, puis une dilution est effectu\u00e9e en cascade jusqu\u2019\u00e0 10-7.
\nOn proc\u00e8de \u00e0 un d\u00e9nombrement sur boite TSA (de 10-3 \u00e0 10-7) apr\u00e8s 24h d\u2019incubation \u00e0 37\u00b0C
\nLe reste de la culture est centrifug\u00e9 (3 min \u00e0 10000 tour\/min).\u2028Le surnageant contenant l\u2019ADNe est ensuite pr\u00e9lev\u00e9 et st\u00e9rilis\u00e9 par filtration (filtre seringue 20\u03bcm). Le filtrat ainsi obtenu est stock\u00e9 \u00e0 -20\u00b0C.
\nLes surnageants r\u00e9cup\u00e9r\u00e9s seront quantifi\u00e9s gr\u00e2ce \u00e0 un dosage au Picogreen.<\/p>\n

\u2022 Dosage au fluorim\u00e8tre:
\nPour ce dosage, un kit PicoGreen est utilis\u00e9, par fluorescence celui-ci permet le dosage des acides nucl\u00e9iques avec l\u2019\u00e9tablissement d\u2019une courbe \u00e9talon.<\/p>\n

Pr\u00e9paration de la gamme :
\nUtilisation d\u2019une solution m\u00e8re d\u2019ADN de phage lambda \u00e0 2\u03bcg\/ml dans du TE pour la r\u00e9alisation de la gamme \u00e9talon. Puis diff\u00e9rents tubes \u00e0 diff\u00e9rentes concentrations sont pr\u00e9par\u00e9s (Tableau 1):<\/p>\n

Dosage des \u00e9chantillons: \u2028Sur une micro-plaque, 100\u03bcl sont d\u00e9pos\u00e9s que ce soit de la gamme ou des \u00e9chantillons \u00e0 doser.
\n2\u03bcl de chaque \u00e9chantillon est pr\u00e9alablement dilu\u00e9s dans 98\u03bcl de TE 1X.<\/p>\n

Juste avant l\u2019analyse 100\u03bcl de fluorochrome dilu\u00e9 (50\u03bcl de Picogreen dans 10ml de TE 1X) et ensuite ajout\u00e9 dans chaque puits.
\nL\u2019analyse se fait au Fluoroscan (Labsytem) avec une excitation \u00e0 485 nm et une lecture \u00e0 538nm.<\/p>\n

\n5. Outils statistiques<\/h3>\n

Les mesures de chaque souche ont \u00e9t\u00e9 r\u00e9alis\u00e9es en deux ou en trois r\u00e9plicas.<\/p>\n

Pour l\u2019analyse statistique de mes r\u00e9sultats, deux types d\u2019analyse ont \u00e9t\u00e9 effectu\u00e9es: L\u2019Analyse en Composante Principale (ACP ou PCA) et la Classification Ascendante Hi\u00e9rarchique (CAH).\u2028\u2028La CAH permet d\u2019obtenir un dendrogramme qui regroupe les souches entre elles. Celui ci est form\u00e9 par agr\u00e9gations successives en comparant chaque souche entre elles suivant les diff\u00e9rentes variables que l\u2019on a choisi. Le dendrogramme obtenu est une sorte d\u2019arbre phylog\u00e9n\u00e9tique o\u00f9 les individus qui sont proches ont des variables comparables.<\/p>\n

Cette classification prend donc en compte toutes les variables sans pond\u00e9ration pour l\u2019une ou l\u2019autre.\u2028L\u2019ACP permet de comparer des variables vis \u00e0 vis d\u2019une seule qui est dans notre cas la production de biofilm. Elle va permettre de r\u00e9duire \u00e0 deux dimensions l\u2019ensemble de donn\u00e9es qui contient 4 variables. On obtient ainsi un cercle de corr\u00e9lation avec les deux axes qui contiennent \u00e0 eux seuls le maximum d\u2019information et la repr\u00e9sentation sous forme de vecteur de chacune des variables.<\/p>\n

Utilisation du logiciel R pour ces tests avec l\u2019interface graphique R commander et le package FactoMineR.<\/p>\n

\n

RESULTATS<\/h3>\n

1. Cin\u00e9tique de croissance des souches<\/h3>\n

La premi\u00e8re partie de cette \u00e9tude \u00e9tait de caract\u00e9riser 54 souches de L.monocytogenes. Avec le Bioscreen, nous avons pu d\u00e9terminer la courbe de croissance de chaque isolat.<\/p>\n

Les trois phases de croissance des bact\u00e9ries en milieu liquide sont ici bien identifi\u00e9es, on observe la premi\u00e8re phase d\u2019adaptation puis une augmentation qui correspond \u00e0 la phase de croissance exponentielle et enfin la phase stationnaire.<\/p>\n

Ces diff\u00e9rentes courbes de croissance ont permis d\u2019obtenir diff\u00e9rents facteurs tel que le taux de croissance calcul\u00e9 sur la phase exponentielle, la DO maximum atteinte ou bien encore la dur\u00e9e de la phase exponentielle. Ces param\u00e8tres sont not\u00e9s dans le tableau suivant (Tableau 2). Les courbes nous ont aussi permis d\u2019obtenir le temps et la DO correspondante \u00e0 la demi phase exponentielle qui ont \u00e9t\u00e9 utilis\u00e9 par la suite pour les pr\u00e9l\u00e8vements d\u2019ADN extracellulaire.<\/p>\n

\nLes souches ont \u00e9t\u00e9 class\u00e9es en 4 groupes (rouge, orange, jaune et vert) suivant les trois param\u00e8tres du tableau gr\u00e2ce \u00e0 un outil statistique de Classification hi\u00e9rarchique par la m\u00e9thode de Ward. Ceci a permis de regrouper les souches qui ont des donn\u00e9es semblables. On observe par exemple que H22 et H29 sont deux souches qui ont un taux de croissance faible mais une DO maximum tr\u00e8s \u00e9lev\u00e9e. Les souches ont en g\u00e9n\u00e9rale les taux de croissance les plus \u00e9lev\u00e9s et les dur\u00e9es de phase exponentielle les plus courtes.<\/p>\n

Pour permettre la comparaison, la colonne du nom des souches est l\u00e9gend\u00e9e elle aussi mais cette fois les couleurs sont attribu\u00e9es selon leur origine, suivant la l\u00e9gende du tableau 1.
\nAinsi nous pouvons observer que dans chacun des groupes statistiquement form\u00e9s, il y a des souches de toutes les origines.<\/p>\n

\n

2. Formation de biofilms<\/h3>\n

Chaque souche a pu former un biofilm dans les puits. La quantit\u00e9 form\u00e9e a \u00e9t\u00e9 quantifi\u00e9e en mesurant l\u2019absorbance. Cette absorbance mesur\u00e9e est proportionnelle \u00e0 la quantit\u00e9 de biofilm qui a \u00e9t\u00e9 produite pendant les 16 heures d\u2019incubation.\u2028La quantit\u00e9 de biofilm pour chacune des souches class\u00e9es suivant leur origine est pr\u00e9sent\u00e9e figure 4.<\/p>\n

Quelle que soit l\u2019origine des souches, il y a une tr\u00e8s forte variabilit\u00e9 de la quantit\u00e9 de biofilm. Par ailleurs on voit des \u00e9cart-types tr\u00e8s \u00e9lev\u00e9s pour certaines souches tel
\nque ScottA, H21, H33 et H16, il est donc \u00e9vident que d\u2019autres r\u00e9plicas auraient \u00e9t\u00e9 n\u00e9cessaires pour pouvoir exploiter ces r\u00e9sultats avec plus de suret\u00e9.\u2028La valeur de H33 \u00e9tant tellement \u00e9lev\u00e9e, elle n\u2019a pas \u00e9t\u00e9 utilis\u00e9e par la suite lors de l\u2019analyse statistique car elle faussait les r\u00e9sultats.<\/p>\n

\n

3. Dosage de l\u2019ADN extracellulaire<\/h3>\n

Les pr\u00e9l\u00e8vements d\u2019ADN extracellulaire ont \u00e9t\u00e9 fais \u00e0 la demi phase exponentielle et en phase stationnaire apr\u00e8s 15 heures d\u2019incubation. Pour le pr\u00e9l\u00e8vement en demi phase stationnaire, nous nous sommes bas\u00e9s sur les donn\u00e9es d\u2019absorbance obtenu avec le Bioscreen.\u2028On observe les r\u00e9sultats dans le tableau 3.\u2028Tout comme pour les r\u00e9sultats du Bioscreen, les souches ont \u00e9t\u00e9 class\u00e9es en 4 groupes (rouge, orange, jaune et vert) suivant les deux param\u00e8tres du tableau gr\u00e2ce \u00e0 un outil statistique de Classification hi\u00e9rarchique par la m\u00e9thode de Ward. Ceci a permis de regrouper les souches qui ont des donn\u00e9es semblables. On observe que les souches produisant le plus d\u2019ADNe sont plut\u00f4t dans les groupes rouge\/orange alors que celles ayant des concentrations plus faibles, sont plut\u00f4t class\u00e9es dans les deux autres groupes.
\nAinsi nous pouvons observer qu\u2019il ne semble pas y avoir de rapprochement entre la quantit\u00e9 d\u2019ADNe produit et l\u2019origine des souches.<\/p>\n

On observe qu\u2019il y a une grande variabilit\u00e9 de quantit\u00e9 d\u2019ANDe lors de la phase exponentielle, de 180 \u00e0 766 ng\/ml. En phase stationnaire les valeurs sont comprises entre 330 et 830 ng\/ml.
\nOn observe aussi qu\u2019\u00e0 l’exception de quelques souches, la quantit\u00e9 d\u2019ADNe a augment\u00e9 en phase stationnaire.<\/p>\n

Afin d\u2019\u00e9valuer la possibilit\u00e9 d\u2019une corr\u00e9lation entre la production d\u2019ADNe et la quantit\u00e9 de biofilm \u00e0 16h, ces 2 param\u00e8tres ont \u00e9t\u00e9 repr\u00e9sent\u00e9s sur un m\u00eame graphique (fig.5).<\/p>\n

Au vu de l\u2019observation de ce diagramme, il semblerait que la capacit\u00e9 \u00e0 produire du biofilm \u00e0 16h ne soit pas en lien avec la production d\u2019ADN extracellulaire par les souches de L. monocytogenes.<\/p>\n

\n4. Analyses Statistiques<\/h3>\n

En proc\u00e9dant ensuite \u00e0 une classification ascendante hi\u00e9rarchique, les souches ont \u00e9t\u00e9 group\u00e9es en fonction de leurs param\u00e8tres cin\u00e9tiques, leur production d\u2019ADNe et leur capacit\u00e9 \u00e0 former des biofilm \u00e0 16h.
\nComme le montre le dendrogramme (fig.6), les groupes ont \u00e9t\u00e9 identifi\u00e9s.<\/p>\n

L\u2019analyse en composante principale a pu comparer entre elles les trois variables que sont le taux de croissance, l\u2019ADNe en demi phase exponentielle et l\u2019ADNe en phase stationnaire vis \u00e0 vis de la production de biofilm.
\nLa repr\u00e9sentation des covariances sur le cercle de corr\u00e9lation (fig.7) montre que plus de 94% des variations sont expliqu\u00e9s avec les deux axes.<\/p>\n

Chaque vecteur repr\u00e9sente donc une des variables, et plus ces vecteurs sont \u00e0 la fois proches entre eux et proche du cercle de corr\u00e9lation, plus il nous est possible de supposer que ces variables sont corr\u00e9l\u00e9es.
\nOn voit par exemple que les deux mesures d\u2019ADNe semble plut\u00f4t corr\u00e9l\u00e9, par contre le vecteur repr\u00e9sentant la production de biofilm \u00e9tant tr\u00e8s \u00e9loign\u00e9 du cercle il ne semble corr\u00e9l\u00e9 \u00e0 aucun autre facteur.
\nCeci est v\u00e9rifi\u00e9 en regardant les graphiques de corr\u00e9lation pr\u00e9sents dans l\u2019Annexe 2.<\/p>\n

Toutes les souches sont report\u00e9es sur les axes de l\u2019ACP (fig.8) en fonction de leurs valeurs pour chacun des param\u00e8tres. Les ellipses de couleurs repr\u00e9sentent les groupes obtenus pr\u00e9c\u00e9demment gr\u00e2ce \u00e0 la classification ascendante hi\u00e9rarchique (fig.6).<\/p>\n

Les souches sont donc positionn\u00e9es sur les axes de variabilit\u00e9 de l\u2019ACP, leur positionnement confirme les groupes pr\u00e9alablement form\u00e9s par classification. Comme les souches H14 et H16 du groupe bleu, les souches qui sont proches sur ce graphique, ont des valeurs pour les diff\u00e9rents param\u00e8tres qui sont semblables. Si on analyse les ellipses form\u00e9es sur la figure 8 et que l\u2019on regarde par rapport aux axes de L\u2019ACP ; l\u2019axe 1 (Dim1) d\u2019apr\u00e8s la figure 7, semble \u00eatre en lien avec la production d\u2019ADNe pr\u00e9lev\u00e9e en phase stationnaire on peut donc en conclure que les souches contenu dans l\u2019ellipse ont une production \u00e9lev\u00e9e d\u2019ADNe en phase stationnaire. L\u2019axe 2 (Dim2) semble quant \u00e0 lui \u00eatre expliqu\u00e9 par le taux de croissance (fig.7), les souches contenues dans l\u2019ellipse rouge en plus de produire peu d\u2019ADNe mettent du temps \u00e0 se d\u00e9velopper.<\/p>\n

\nAinsi nous pouvons observer sur ce graphique qu\u2019il n\u2019y a pas de corr\u00e9lation entre l\u2019origine des souches et les groupes form\u00e9s statistiquement. L\u2019origine n\u2019influence dons pas les quatre facteurs \u00e9tudi\u00e9s et sur les deux axes de l\u2019ACP.<\/p>\n

En faisant le m\u00eame type de graphique mais cette fois ci en classant les souches selon leur lign\u00e9 ou leur s\u00e9rotype, on obtient les m\u00eames r\u00e9sultats (Annexe 3). Ces deux variables qualitatives ne semblent pas avoir non plus sur les quatre variables mesur\u00e9es.<\/p>\n

\nINTERPRETATION ET DISCUSSION<\/h3>\n

L. monocytogenes est un pathog\u00e8ne opportuniste ubiquiste qui peut donc se d\u00e9velopper dans des environnements tr\u00e8s vari\u00e9s. Le s\u00e9quen\u00e7age du g\u00e9nome de L.monocytogenes a mis en \u00e9vidence un grand nombre de m\u00e9canismes d\u2019adaptation (Buchrieser et al., 2007). L\u2019esp\u00e8ce L. monocytogenes est r\u00e9partie en 4 s\u00e9rogroupes et 13 s\u00e9rotypes distincts.\u2028L\u2019objet de cette \u00e9tude a \u00e9t\u00e9 de comparer la diversit\u00e9 de 54 souches de L.monocytogenes en observant plusieurs param\u00e8tres ph\u00e9notypiques et ensuite de voir si des corr\u00e9lations \u00e9taient possibles.<\/p>\n

En regardant les r\u00e9sultats obtenus pour la cin\u00e9tique des souches, on observe une grande variabilit\u00e9 des caract\u00e9ristiques de d\u00e9veloppement. Certaines souches pouvant atteindre la phase stationnaire en moins de 10 heures alors que pour d\u2019autres 20 heures sont n\u00e9cessaires. N\u00e9anmoins des groupes de souches ayant des caract\u00e9ristiques semblables peuvent \u00eatre observ\u00e9s. Par contre la provenance des souches ne semble pas influencer leurs caract\u00e9ristiques de d\u00e9veloppement.<\/p>\n

Par la suite l\u2019\u00e9tude avait pour but de voir quelle \u00e9tait l\u2019influence de cette biodiversit\u00e9 sur la capacit\u00e9 de L. monocytogenes \u00e0 former des biofilms.\u2028On observe tr\u00e8s clairement que cette diversit\u00e9 se r\u00e9percute sur la formation de biofilm, avec des souches pouvant produire pr\u00e8s de trois fois plus de biofilm que d\u2019autres. L\u00e0 aussi l\u2019origine des souches ou leur s\u00e9rotype ne semble pas influencer leur capacit\u00e9 \u00e0 produire des biofilms.<\/p>\n

Le lien entre la phylog\u00e9nie et la capacit\u00e9 \u00e0 former des biofilms est sujette \u00e0 controverse. Certaines \u00e9tudes aurait montr\u00e9 que certains s\u00e9rotypes (1\/2b et 4b) produiraient plus de biofilm que d\u2019autres (1\/2a et 1\/2c), ce qui aurait un lien avec la pathog\u00e9nicit\u00e9 de certaines souches vis \u00e0 vis de l\u2019homme (Djordjevic et al., 2002). Mais d\u2019autres affirmeraient le contraire (Borucki et al., 2003). Dans notre cas ce lien n\u2019a pas pu \u00eatre mis en \u00e9vidence. \u2028Borucki et al., montrent qu\u2019il y aurait une relation entre la capacit\u00e9 \u00e0 former un biofilm et la persistance dans l\u2019environnement, il n\u2019est pas possible avec nos r\u00e9sultats de montrer cela ; toutefois nous pouvons remarquer que les souches provenant de surfaces abiotiques sont parmi celles qui produisent le plus de biofilm. Ces souches ont \u00e9t\u00e9 pr\u00e9lev\u00e9es dans une usine de production de fromage, connaissant les moyens mis en oeuvre pour l\u2019hygi\u00e8ne et la qualit\u00e9 au sein des entreprises Agroalimentaire, on peut supposer qu\u2019il s\u2019agisse de souches persistantes.<\/p>\n

Dans le d\u00e9veloppement de biofilm, la production d\u2019exopolysaccharides est corr\u00e9l\u00e9 (Borucki et al., 2003) mais il semblerait qu\u2019un autre compos\u00e9, l\u2019ADN extracellulaire permettrait la stabilisation du biofilm chez d\u2019autres micro-organismes (Allesen-holm et al, 2006 ; Lappann et al, 2010) et aussi ches L.monocytogenes (Harmsen et al, 2010).<\/p>\n

C\u2019est pour cela que le dernier facteur \u00e9tudi\u00e9 a \u00e9t\u00e9 la quantit\u00e9 d\u2019ADNe produite. Une fois encore une tr\u00e8s grande variabilit\u00e9 suivant les souches a \u00e9t\u00e9 observ\u00e9. Quatre groupes ont pu statistiquement \u00eatre fait associant les souches produisant des quantit\u00e9s similaires d\u2019ADNe. Ces groupes n\u2019ont pu \u00eatre corr\u00e9l\u00e9s avec l\u2019origine ou le s\u00e9rotypages des souches.<\/p>\n

Par ailleurs nous savons que l\u2019ADNe est un composant essentiel de la matrice du biofilm, aussi bien pour la fixation initiale que pour le d\u00e9but de la formation de celui-ci (Harmsen et al, 2010).<\/p>\n

\u00c9tant donn\u00e9 la quantit\u00e9 de donn\u00e9es obtenues, les traitements statistiques \u00e9taient indispensables pour comparer les diff\u00e9rentes variables. Dans un premier temps tous ces param\u00e8tres ont \u00e9t\u00e9 pris en compte pour une classification ascendante hi\u00e9rarchique. Quatre groupes en sont ressortis.<\/p>\n

L\u2019Analyse en Composante Principale qui a \u00e9t\u00e9 effectu\u00e9 par la suite a permis de comparer objectivement les diff\u00e9rentes variables les unes par rapport aux autres et par rapport \u00e0 la quantit\u00e9 de biofilm. Deux axes ont \u00e9t\u00e9 conserv\u00e9s pour la repr\u00e9sentation graphique, le premier fortement induit par la production d\u2019ADNe en phase stationnaire et le second par le taux de croissance (\u03bc). On observe que mis \u00e0 part les deux productions d\u2019ADNe aucun facteur n\u2019est corr\u00e9l\u00e9 \u00e0 un autre.<\/p>\n

Sur ces axes, les souches sont reparties selon leurs variables, on observe ainsi que les quatre groupes qui \u00e9taient ressortis avec la classification le sont aussi sur les axes de l\u2019ACP.
\nPar contre lorsque l\u2019on regarde avec les facteurs quantitatifs, on observe que les souches sont r\u00e9parties dans toute la figure quelque soit leur origine, lign\u00e9e ou s\u00e9rotype.<\/p>\n

Il est donc difficile d\u2019expliquer le ph\u00e9notype des souches avec ces facteurs.<\/p>\n

La litt\u00e9rature nous d\u00e9montre pourtant que le lien entre l\u2019ADNe et la capacit\u00e9 \u00e0 former un biofilm existe, les conditions d\u2019\u00e9tudes n\u2019\u00e9tait peut \u00eatre pas optimum. Le dosage a \u00e9t\u00e9 effectu\u00e9 dans notre cas avec de l\u2019ANDe produit en demi phase exponentielle et en la phase stationnaire de croissance de L. monocytogenes. Or nous savons que l\u2019ADNe a une importance dans les \u00e9tapes initiales de la formation de biofilm, il aurait peut \u00eatre \u00e9t\u00e9 plus repr\u00e9sentatif pr\u00e9lever \u00e0 ce moment l\u00e0 et non apr\u00e8s 16h comme nous avons pu le faire.<\/p>\n

Listeria monocytogenes est une bact\u00e9rie ubiquiste, elle peut se d\u00e9velopper dans tous types d\u2019environnement comme au sein des Industries Agroalimentaires. Le probl\u00e8me est que sa pathog\u00e9nicit\u00e9 peut causer de grave maladie tel que la list\u00e9riose. La list\u00e9riose humaine r\u00e9sulte principalement de l\u2019ingestion d\u2019aliments contamin\u00e9s. Il y a peu de cas de list\u00e9riose car les personnes \u00e0 risques sont limit\u00e9es aux gens faibles (femmes enceintes, personnes \u00e2g\u00e9es) et immunod\u00e9prim\u00e9s par contre le taux de mortalit\u00e9 pour les personnes contamin\u00e9s est assez \u00e9lev\u00e9 (30%).<\/p>\n

Du fait de \u00e7a pr\u00e9sence dans les process alimentaires, les m\u00e9canismes de survie et d\u2019adaptation de L. monocytogenes sont \u00e9tudi\u00e9s pour comprendre comment l\u2019\u00e9radiquer efficacement.<\/p>\n

Dans notre cas, la capacit\u00e9 \u00e0 produire des biofilms a \u00e9t\u00e9 \u00e9tudi\u00e9e pour 54 souches provenant de 4 origines diff\u00e9rentes. En comparant cette production de biofilms \u00e0 d\u2019autres facteurs caract\u00e9ristiques, le but \u00e9tait de voir si ces facteurs lui \u00e9taient corr\u00e9l\u00e9s.<\/p>\n

L\u2019ensemble des donn\u00e9es obtenues permet de voir la diversit\u00e9 qu\u2019il peut y avoir chez une esp\u00e8ce bact\u00e9rienne. Enfin la confrontation de toutes ces valeurs a montr\u00e9 qu\u2019il n\u2019y avait pas de lien entre les param\u00e8tres \u00e9tudi\u00e9s. Il n\u2019y a donc pas de niches environnementales avec des souches ayant les m\u00eames caract\u00e9ristiques. Toutefois des groupes de souches ayant des caract\u00e9ristiques ph\u00e9notypiques semblables ont pu \u00eatre identifi\u00e9s sans pour autant pouvoir les relier aux donn\u00e9es de la litt\u00e9rature.<\/p>\n

Pour finir, ce stage a \u00e9t\u00e9 pour moi une premi\u00e8re d\u00e9couverte du monde de la recherche, il m\u2019a apport\u00e9 beaucoup d\u2019exp\u00e9rience. J\u2019ai ainsi pu d\u00e9velopper ma curiosit\u00e9 pour un domaine que je n\u2019avais pas encore d\u00e9couvert. Le travail d\u2019\u00e9quipe et les conseils m\u2019ont permis de bien avancer dans ce projet bien que deux mois soient insuffisants pour pouvoir bien appr\u00e9hender le sujet.<\/p>\n

\n

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Auteur: Fran\u00e7ois Xavier Bergeron, 2011. (NB: pour consulter les figures contacter l’auteur) INTRODUCTION 1. Pr\u00e9sentation du Laboratoire 1.1. Pr\u00e9sentation de L\u2019INRA Deuxi\u00e8me institut de recherche public fran\u00e7ais, les recherches de l\u2019Institut National de la Recherche Agronomique sont focalis\u00e9es sur trois th\u00e9matiques: l\u2019agronomie, l\u2019alimentation et l\u2019environnement. 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